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TIRFM系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2020/3/11 點(diǎn)擊量:4520

TIRFM系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用

    TIRFM系統(tǒng)是全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscope)的英文簡(jiǎn)稱。這類顯微鏡是用隱失波作為樣品的激發(fā)光源,并擁有高靈敏度和高時(shí)間分辨率的CCD相機(jī)(成像速率200Hz)捕捉樣品熒光,它的優(yōu)勢(shì)在于比共聚焦顯微鏡的信噪比要高,相對(duì)于其他的光學(xué)顯微鏡,它的分辨率要更高一些,并且相對(duì)于電子顯微鏡來說,對(duì)生物樣本損傷要更小,可以進(jìn)行活體物質(zhì)的研究和單分子的動(dòng)態(tài)研究。
    全內(nèi)反射熒光顯微鏡憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(它的熒光激發(fā)深度只在0~100nm的薄層范圍內(nèi)),從而被廣泛用于實(shí)時(shí)觀察單個(gè)肌漿球蛋白分子的運(yùn)動(dòng)、單個(gè)蛋白分子對(duì)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、ATP酶的翻轉(zhuǎn),聚合物內(nèi)單個(gè)分子的結(jié)構(gòu)變化、以及等離子體膜附近的神經(jīng)分泌腺的顆粒運(yùn)動(dòng)等方面,成為研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動(dòng)力學(xué)、單分子動(dòng)力學(xué)的zui有前途的光學(xué)成像技術(shù)。
一、在生物單分子科學(xué)領(lǐng)域,單分子熒光探測(cè)主要有三個(gè)問題:
    1)單分子發(fā)出的熒光信號(hào)通常很微弱的,所以要尋找一個(gè)足夠靈敏的探測(cè)器;
    2)由于拉曼散射,瑞利散射和雜質(zhì)熒光等產(chǎn)生的背景光,極大的干擾了信號(hào)光的探測(cè),所以應(yīng)該盡量降低背景激發(fā)光;
    3)本體溶液產(chǎn)生的焦點(diǎn)熒光之外的背景光。

    這些問題都可以利用TIRFM系統(tǒng)即全內(nèi)反射熒光顯微鏡來解決!
二、觀察蛋白分子的相互作用
    1)通過熒光表識(shí)的分子共同定位,運(yùn)用全內(nèi)反射熒光顯微鏡對(duì)分子間相互作用可以直接觀察,熒光共聚焦能量轉(zhuǎn)移也能夠檢測(cè)到。
    2)分子伴侶蛋白GroEL和伴侶輔助分子GroEState或者其底物乳球蛋白的相互作用已經(jīng)在單分子水平進(jìn)行了很好的研究。

三、應(yīng)用于離子通道的研究
    熒光標(biāo)識(shí)的離子通道蛋白包埋到平面脂雙層中,然后用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察。利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移或者雙視角的光鏡可以看到離子通道與其配基或者調(diào)節(jié)子之間的相互作用,同時(shí)可以在體內(nèi)跟蹤結(jié)像變化與離子電流。
四、用于DNA大分子在液-液,固-液界面的單分子吸附行為。

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